3. 文库制备材料8 μl总量为300 ng的带PolyA尾RNA 或8 μl总量为1 µg的总RNA逆转录接头（RTA）RNA参照品（RCS）清洗缓冲液（WSB）RNA连接接头（RLA）RNA洗脱缓冲液（REB）耗材Agencourt RNAClean XP磁珠 （Beckman Coulter®，A63987）Induro® 逆转录酶 和 5x Induro® 逆转录反应缓冲液（NEB，M0681）10mM 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）溶液（例如 NEB N0447）NEBNext®快速连接反应缓冲液（NEB，B6058）2M U/ml 的 T4 DNA连接酶 （NEB，M0202）小鼠RNase 抑制剂（NEB，M0314）无核酸酶水（如ThermoFisher，AM9937）新制备的70％乙醇（用无核酸酶水配制）0.2 ml 薄壁PCR管1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管Qubit™ RNA HS Assay（RNA高灵敏度检测）试剂盒（ThermoFisher，Q32852）Qubit™ dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q32851)Qubit™ 分析管（Invitrogen, Q32856）仪器涡旋混匀仪迷你离心机热循环仪Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）磁性分离架Qubit™ 荧光计（或用于质控检测的等效仪器）盛有冰的冰桶P1000 移液枪和枪头P200 移液枪和枪头P100 移液枪和枪头P20 移液枪和枪头P10 移液枪和枪头P2 移液枪和枪头 Eppendorf 5424 离心机（或等效器材）对测序芯片进行质检我们建议您在制备文库前对测序芯片进行质检，以确认活性纳米孔数量充足，确保测序顺利进行。
请按照测序芯片质检 文档中的说明进行操作。
根据生产厂家的说明准备NEBNext®快速连接反应缓冲液和T4 DNA连接酶，并置于冰上： 将T4 DNA连接酶置于冰上，并于室温下解冻NEBNext®快速连接反应缓冲液。
将各试剂瞬时离心5秒。
上下吹打各整管试剂10次，以确保充分混匀。请注意：切勿涡旋振荡 T4 DNA 连接酶。
NEBNext 快速连接反应缓冲液内可能出现少量沉淀。待试剂回复至室温后，使用移液枪上下吹打数次，打散沉淀；然后涡旋振荡数秒，以确保试剂充分混合。
此实验指南中，我们不推荐使用快速T4连接酶。我们发现T4 DNA连接酶（2M U/ml - NEB M0202M）效果更佳。使用时需要配合快速连接反应缓冲液（NEB B6058）。将逆转录接头（RTA）、RNA参照品（RCS）（如使用）、及RNA连接接头（RLA）瞬时离心，吹打混匀后置于冰上。室温下解冻清洗缓冲液（WSB）和RNA洗脱缓冲液（REB），然后涡旋振荡混匀，随后瞬时离心，并将试剂置于冰上。准备溶于无核酸水中的RNA： 将300 ng 带poly(A)尾的RNA 或1 µg的总RNA转移至一支0.2 ml 薄壁PCR管中。 如不足8 μl，请加入无核酸酶水补足。 为避免不必要的打断，请轻弹试管以充分混匀。 使用迷你离心机快速离心。 使用RNA参照品（RCS）并非必需，它的主要目的是为了便于建库质控和问题排查。我们推荐您在制备文库时，加入RNA参照品，以便日后进行问题排查。
请注意： 根据试剂盒批次，提供的RNA参照品（RCS）浓度有所不同，因此使用方法也略有差异。请您参照所用RCS管的浓度，确保选择并遵循正确的操作步骤和起始用量：
我们已提高新批次SQK-RNA004及EXP-RCS001中RNA参照品（RCS）的浓度。
RNA004.20.xxxx 或更早批次中 RNA004.30.0001 或更新批次中 RNA参照品（RCS）的浓度较低： 15 ng/µl RNA参照品（RCS）的浓度较高： 50 ng/µl RCS001.10.xxxx 或更早批次中 RCS001.20.0001 或更新批次中 RNA参照品（RCS）的浓度较低： 15 ng/µl RNA参照品（RCS）的浓度较高： 50 ng/µl 按下述步骤制备逆转录接头 (RTA) 连接反应体系：如您选择不在逆转录接头（RTA）连接反应体系中加入RNA参照品（RCS），请以等体积的无核酸酶水替代RCS的体积。
若您使用的是批次为 RNA004.30.0001 或更新版本的试剂盒，其中包含高浓度RNA参照品（RCS）：
1. 另取一支洁净的 0.2 ml 薄壁 PCR 管，按下表在管中稀释 RNA 参照品（RCS）：
试剂 体积 RNA 参照品（RCS） 1 µl 无核酸酶水 2 µl 总体积 3 µl 2. 使用移液枪吹打10次以确保充分混匀。
3. 在 已装有RNA样本 的 0.2 ml 薄壁PCR管中，按以下顺序加入试剂：
试剂 体积 RNA 8 µl NEBNext 快速连接反应缓冲液 3 µl 稀释后的RNA 参照品 (RCS) 或 无核酸酶水 0.5 µl 小鼠RNase 抑制剂 1 µl 逆转录接头 (RTA) 1 µl T4 DNA 连接酶 1.5 µl 总体积 15 µl 若您使用的是批次为 RNA004.20.xxxx 或更早版本的试剂盒，其中包含低浓度RNA参照品（RCS）：
1. 在装有RNA样本的 0.2 ml 薄壁PCR管中，按以下顺序加入试剂：
试剂 体积 RNA 8 µl NEBNext 快速连接反应缓冲液 3 µl RNA 参照品 (RCS) 或 无核酸酶水 0.5 µl 小鼠RNase 抑制剂 1 µl 逆转录接头 (RTA) 1 µl T4 DNA 连接酶 1.5 µl 总体积 15 µl 吹打混匀，并瞬时离心。室温下孵育10 分钟。在一支洁净的1.5ml DNA LoBind Eppendorf离心管中，混合下表中试剂，制备逆转录预混液：试剂 体积 无核酸酶水 13 µl 10 mM dNTPs 2 µl 5x Induro 逆转录反应缓冲液 8 µl 总体积 23 µl 将预混液加入已连接逆转录接头的RNA 中（0.2ml PCR 管内），吹打混匀。将2 μl Induro 逆转录酶加入反应体系中，吹打混匀。将PCR管放入热循环仪中，于60℃下孵育30分钟，再于70℃下孵育10分钟，待样品降温至4℃后，进行下一步操作。将PCR管瞬时离心，然后转移样品至一洁净的1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管中。涡旋振荡以重悬Agencourt RNAClean XP 磁珠。将72ul 重悬的AMPure RNAClean XP 磁珠加入逆转录反应体系中，用移液枪吹打混匀。将离心管置于Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）上室温孵育5分钟。准备200μl 新制备的70％乙醇（用无核酸酶水配制）。将样品瞬时离心，并静置于磁力架上待磁珠和液相分离。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸去上清液。保持离心管在磁力架上不动，然后依照如下说明，以150μl新鲜制备的70%乙醇洗涤磁珠： 向离心管内加入150μl新鲜制备的70%乙醇，并确保磁珠在离心管的一侧聚集。 保持磁力架在实验台上不动，将含有磁珠的离心管旋转180°。 待磁珠向磁铁处移动并聚集后，再将离心管旋转180°（即离心管回到原位），并静置
至磁珠与液相分离。 用移液枪将70%乙醇小心吸走并弃掉。瞬时离心，然后将离心管静置于磁力架上，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。保持离心管在磁力架上不动，用移液枪吸去残余的乙醇。将离心管从磁力架上移开，将磁珠重悬于23μl 无核酸酶水中。在室温下孵育5分钟。将离心管静置于磁力架上，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。将此23µl洗脱液转移至一支新的1.5ml Eppendorf DNA LoBind管中。在此阶段，您可将RT-RNA存储在-80°C下以备后用。请注意，这是本实验指南中唯一可以暂停的节点。
在同一支1.5ml Eppendorf DNA LoBind离心管中，将所有试剂按以下顺序混合：试剂 体积 经过逆转录的RNA 23 µl NEBNext 快速连接反应缓冲液 8 µl RNA 连接接头（RLA） 6 µl T4 DNA 连接酶 3 µl 总体积 40 µl 吹打混匀。室温下孵育10 分钟。涡旋振荡以重悬Agencourt RNAClean XP 磁珠。将16 µl 重悬的Agencourt RNAClean XP 磁珠加入接头连接反应体系中，用移液枪吹打混匀。将离心管置于Hula混匀仪（低速旋转式混匀仪）上室温孵育5分钟。将样品瞬时离心，并静置于磁力架上5分钟，直到磁珠和液相分离。用移液枪吸去清液。向磁珠中加入150 μl 清洗缓冲液（WSB）。盖上管盖，轻弹离心管以重悬磁珠。将离心管静置于磁力架上5分钟，直到磁珠与液相分离，吸走上清液。重复上述步骤。加入清洗缓冲液后，与立即吸走清液相比，轻弹离心管重悬磁珠能更有效地去除游离的测序接头。将离心管瞬时离心后置于磁力架上，直到磁珠与液相分离。然后吸走残留的清洗缓冲液（WSB）。将离心管从磁力架上移开。将磁珠重悬于13μl RNA 洗脱缓冲液（REB）中，轻弹离心管以混匀。室温下孵育10 分钟。将离心管静置于磁力架上5分钟，直到磁珠和液相分离，且洗脱液澄清无色。将13μl 洗脱液转移至一支新的1.5ml Eppendorf DNA LoBind 管中。取 1 μl 逆转录并连接接头的 RNA，使用 Qubit™ 双链DNA高灵敏度检测（dsDNA HS assay）试剂盒在 Qubit™ 荧光计上进行定量检测。洗脱液中的目标回收量应高于30 ng。
不同起始材料和文库之间的回收量可能存在差异。我们建议您保留全部体积的RNA文库，以获得最佳的测序结果。
经过逆转录及接头连接的RNA即可用于测序芯片上样。请立即为RNA文库测序，切勿储藏待后续使用。